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本發明公開了一種基于反蛋白石結構水凝膠的心肌細胞檢測方法及其應用，包括以下步驟：1)制備生物相容性的反蛋白石結構水凝膠；2)基于反蛋白石結構水凝膠心肌細胞的培養；3)心肌細胞的檢測；4)數據的分析。本發明中的反蛋白石結構色水凝膠具備良好的生物相容性，細胞在其表面生長保持高活性和表型，反蛋白石結構水凝膠不僅為心肌細胞的生長提供載體，更重要的是為心肌細胞收縮力和跳動頻率的檢測提供穩定的光學傳感信號，該檢測方法不需要復雜的檢測系統，具備直觀性、高靈敏行、高效、不受外界條件影響的優勢；該方法可應用于心臟藥物

【發 明 人】劉培；唐宗湘；段金廒；楊雁；劉睿；于金高 【摘要】 本發明公開了一種具有致癢作用的芋蛋白提取物，它的氨基酸序列為：Ser-Gln-Leu-Asn-Phe- Tyr-Gln-Gly-Lys-Gly-Gln-Gly-Asn-Phe-Leu-Val-Ala-Val-Asp。本發明通過采用超濾、離子交換層析、凝膠柱層析、超濾或透析除鹽等技術，制備得到純度高，具有很好致癢活性的芋蛋白提取物，該芋蛋白提取物可廣泛應用于致癢模型工具藥研究、生物檢測、疾病診斷和治療等方面，為芋資源的綜合高效利用提供基礎，具有重要的意義。

本發明公開了一種C反應蛋白柔性汗液電化學傳感器的制備方法。傳感器由CRP工作電極、碳對電極、銀?氯化銀參比電極組成，通過結合MIP和卟啉金屬有機框架材料（PMOFs）?金鉑雙金屬納米顆粒復合物，特異性檢測汗液中的CRP含量。卟啉用作仿生催化劑，模擬細胞色素酶（P450）的催化效果，配合具有等離子體增強電化學氧化性能的金鉑雙金屬納米顆粒（AuPt NPs），顯著提高了電子傳輸效率，放大檢測信號，從而提升傳感器的靈敏度。本發明CRP柔性汗液電化學傳感器具有制備方法簡單，成本低廉，能夠無創、快速檢測汗液CRP含量，全面捕捉人體炎癥狀態的變化趨勢，靈敏度高等優勢，對汗液CRP的高穩定性和高特異性監測具有重要意義。

一、成果簡介 目前，鈣營養不足時當今全球性健康問題，缺鈣所導致的生命活動出現障礙，以及引發疾病的發生已經越來越受到重視。世界衛生組織調查結果表明，全球有20億以上人患有鐵缺乏癥，缺鐵稱為第九類健康風險因素，因此，改善鐵營養狀況，是世界也是我國迫切需要解決的問題。但是目前市場常見的補鈣劑、補鐵劑具有毒副作用，且吸收率不高，導致補鈣效果不佳，所以開發更好的補鈣產品和補鐵試劑勢在必行。

本項目主要進行冰箱冷柜用速凍技術的開發，以提高凍結產品質量，減少 冷凍時間，降低能耗。速凍技術的定義：食品中心溫度從-l℃下降至-5℃所需的 時間在 30 min 以內，屬于快速凍結，超過 30min 則屬于緩慢凍結。?

安貝生坦 (ambrisentan) 是由美國Gilead Science公司開發的一種內皮素受體拮抗劑，該藥物 以S-活性構型于2007年6月獲得美國FDA批準上市，商品名為Letairis，口服用于治療肺動脈高血 壓。它是繼波生坦和西他生坦之后第三個上市的內皮素受體拮抗劑，具有治療效果好、安全性 高、藥物相互作用少、給藥方式簡便等優點，已經成為該類藥的重點產品。 華東理工大學近年來成功開發了安貝生坦合成工藝，做到工藝簡便、收率高。所開發的安貝生坦合成路線，所有原材料都立足于國內，反應步驟簡潔，操作簡便，無昂 貴的輔助試劑，易于規模化生產。

本發明涉及一類新型重組融合蛋白，其基本結構為{GLK}p-R-{GLK}q，其中R是有生物學功能的蛋白或多肽，GLK為重組明膠樣蛋白(gelatin-like protein，GLK)，具有(Gly-X-Y)n明膠結構特征的蛋白序列。與未融合有GLK片段的原始蛋白/多肽相比較，這類重組明膠樣融合蛋白具有更高的親水性，在體內具有更長的半衰期。本發明也包括編碼該融合蛋白的核苷酸序列，含核苷酸序列的表達載體，轉化有該類載體的宿主細胞以及制備本發明所涉及的融合蛋白的方法。此外，還包含含有該類融合蛋白的藥用組合物以及用于治療、預防或緩解疾病的方法。

泛素-蛋白酶體體系（Ubiquitin-Proteasome System，簡稱UPS）是細胞內最重要的蛋白質降解通路，對維持生物體內蛋白質的濃度平衡，以及對調控蛋白、錯誤折疊或受到損傷的蛋白的快速降解起著至關重要的作用，參與了細胞周期、基因表達調控等多種細胞進程，由UPS失常引發的蛋白質新陳代謝異常與眾多人類重大疾病直接相關。2004年，Aaron Ciechanover, Irwin Rose和Avram Hershko三位科學家被授予了諾貝爾化學獎，以表彰他們對該降解通路的發現。UPS中蛋白酶體是細胞中最基本的、最重要的不可或缺的、最為復雜的大型全酶超分子復合機器之一，人源蛋白酶體全酶包含至少33種不同的亞基，總原子質量約為2.5MDa。美國FDA批準的多種治療癌癥的藥物分子即以蛋白酶體為直接靶標。近年來，隨著冷凍電鏡技術的發展和應用，人們對這一大分子機器的結構和功能研究得以不斷深入。2016年，毛有東課題組與合作者報道了人源蛋白酶體基態的3.6?冷凍電鏡結構及其他三個亞納米分辨構象，并首次發現一個亞穩態構象的核心顆粒（Core Particle，簡稱CP）底物轉運通道處于開放狀態（見PNAS 2016, 113: 12991-12996）。2018年4月，該課題組又報道了6個ATPγS結合狀態下的26S動態結構，包括三個CP開放態對應的亞穩簡并態近原子分辨（4~5?）結構（見Nature Communications 2018, 9: 1360）。盡管這些工作揭示了蛋白酶體的基本架構和內在運動行為，但由于缺乏蛋白酶體與底物之間的相互作用，人們對于蛋白酶體如何實現底物降解的原子水平工作機制仍一無所知。此外，盡管冷凍電鏡技術近年來廣泛應用于分析具有動態特征的蛋白復合體結構和平衡態構象，但對其中間態結構和非平衡構象分析的分辨率水平往往局限在4～6?；蚋停x真正的全原子水平動力學分析還有相當一段距離。 為了真正實現原子水平的蛋白酶體底物降解動態過程的冷凍電鏡三維重建和動力學表征，毛有東課題組攻克了兩大技術難題。其一，如何在蛋白酶體完成底物降解之前抓到它的所有可能的中間態構象？課題組發展了一種新穎的核酸置換法，利用ATPγS降低AAA-ATPase激酶水解活性的特點，在底物降解中間過程，通過將ATP快速置換成ATPγS，結合快速冷凍的優勢，從而撲捉到蛋白酶體在底物降解過程的中間態。其二，如何在從冷凍電鏡數據中分析出更多構象的同時，還把分辨率做到3埃甚至更好？課題組通過多年持續努力，發展了多種基于人工智能和機器學習的冷凍電鏡圖像聚類的新型算法，并針對蛋白酶體的動力學特征，設計了一套極其有效的整合了多種算法的多構象分類流程。通過這兩套技術方案的完美結合，課題組成功解析了人源蛋白酶體在降解底物過程中的七種不同的、但差別甚微的、高分辨原子水平的天然態構象（Native states），完整展示了蛋白酶體從泛素結合到去泛素化，再到底物轉運的動態過程。與同期在Science上發表的與底物結合的酵母蛋白酶體的4.2-4.7埃冷凍電鏡結構（Science doi: 10.1126/science.aav0725，來自加州伯克利分校和Scripps研究所）相比，該Nature論文不僅總構象數量多一倍，全部構象分辨率還高1-2埃。由于Science論文采用了抑制Rpn11去泛素活性的策略，其非天然態結構中底物并不能真正自由轉運，所推測的機理僅限于底物轉運這一步，對于其他三大Nature論文所回答重要問題均無法給出答案。這體現了該Nature論文不僅在實驗方法的原創性上和數據分析水平和質量上，更在科學發現和問題探究的深度和廣度上大幅超越了來自Science的競爭性論文。圖一 七個利用冷凍電鏡解析的精細原子結構完整揭示了從泛素識別、去泛素化反應、轉運啟動和持續降解的核心功能動態過程。 作為整個蛋白酶體的動力來源與運轉核心，AAA-ATPase激酶分子馬達展現出了三種不同的核苷酸水解協作模式，6個ATPase亞基協調工作，交替與底物發生相互作用。在去泛素化過程（EB態）中，處于對立位置的兩個ATPase亞基Rpt2與Rpt4水解ATP，而Rpt5與Rpt6則釋放ADP，ATPase內的底物轉運通道被打開，使得底物可以進入軸心通道；與此同時，去泛素化酶Rpn11亞基與泛素及底物發生相互作用，執行其作為去泛素化酶的功能；在轉運起始過程（EC態）中，相鄰的兩個ATPase亞基Rpt1與Rpt5會同時水解ATP，調控顆粒（Regulatory Particle，簡稱RP）發生大規模轉動并釋放泛素；在底物去折疊與轉運過程（ED態）中，三個相鄰的ATPase亞基會分別同步進行ATP的結合、ADP的釋放與ATP的水解，這一過程會單向傳遞下去，將ATP水解釋放的化學能轉換為機械能，使得相應的ATPase亞基發生剛體轉動，推動底物的去折疊和單向輸運，同時CP的轉運通道入口打開，底物被送入通道中進行降解。這些研究結果為幾十年來對蛋白酶體功能的研究提供了寶貴的第一手原子結構和動力學信息，對于理解生物體內蛋白質的降解過程和一系列負責物質輸運的ATPase馬達分子的一般工作原理具有極為重要的科學意義。

組蛋白的翻譯后修飾對于表觀遺傳調控及多種生物學過程具有重要意義。一系列新的賴氨酸化學修飾（如巴豆?；㈢牾；龋┱故境鼋M蛋白修飾前所未有的多樣性及動態變化特征?？蛇z傳編碼的光交聯探針已經成為研究活細胞內蛋白-蛋白相互作用的重要工具，成功地將該技術拓展到組蛋白的化學修飾研究中，開發了可遺傳編碼的組蛋白光親和標簽，將會極大地推動組蛋白化學修飾的識別機制和功能研究。?該技術的設計包括兩個部分：a）一套帶有翻譯后修飾的賴氨酸遺傳編碼系統，可以在特定位點插入帶修飾的賴氨酸。此外，在賴氨酸的主鏈上還帶有光交聯基團，可在UV光下與修飾相關的蛋白發生共價交聯，可以用于研究該修飾特定的效應蛋白。b）一套帶有保護基團的賴氨酸遺傳編碼系統，保護基團可以在大腸桿菌自身的還原性環境中發生脫除，將帶有光交聯基團的賴氨酸定點插入到組蛋白當中，用于證實交聯到的效應蛋白的特異性。該團隊以巴豆?；揎棡榇?，發展了該技術對應的賴氨酸巴豆?；揎椀墓饨宦撎结槪↘*cr）和帶有保護基團的光交聯探針（PNBK*）兩個探針，將這兩種探針分別引入到組蛋白H3的56位和79位，并通過光交聯基團捕捉到了H3上79位巴豆?；娜ヒ阴；窼irt3。