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01.成果簡(jiǎn)介 CRISPR/Cas9是細(xì)菌在長(zhǎng)期演化過(guò)程中形成的一種適應(yīng)性免疫防御系統(tǒng)。其工作原理是crRNA通過(guò)堿基配對(duì)與tracrRNA結(jié)合形成tracrRNA/crRNA復(fù)合物，此復(fù)合物引導(dǎo)核酸酶cas9蛋白在與crRNA配對(duì)的序列靶位點(diǎn)剪切雙鏈DNA。經(jīng)過(guò)研究，通過(guò)人工設(shè)計(jì)tracrRNA/crRNA，改造形成具有引導(dǎo)作用的sgRNA，可以引導(dǎo)Cas9蛋白在多種細(xì)胞的特定基因組位點(diǎn)上進(jìn)行切割、修飾，并最終實(shí)現(xiàn)基因突變、插入或缺失。因此，CRISPR/Cas9系統(tǒng)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基因編輯技術(shù)領(lǐng)域。 近年來(lái)，CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)在真核生物和原核生物中得到了廣泛的應(yīng)用。在大腸桿菌等革蘭氏陰性菌中，用一個(gè)載體表達(dá)cas9基因，同時(shí)由于革蘭氏陰性菌重組效率低，需要在這個(gè)載體上表達(dá)λ-RED重組酶；在另一個(gè)載體中表達(dá)sgRNA和用于同源重組的同源臂序列。兩個(gè)載體都轉(zhuǎn)入大腸桿菌中時(shí)，sgRNA介導(dǎo)Cas9蛋白切割基因組上特定序列，形成雙鏈斷裂，刺激同源重組的發(fā)生，從而實(shí)現(xiàn)基因編輯。 本項(xiàng)成果構(gòu)建了適用于鹽單胞菌的基于CRISPR/Cas9的基因編輯系統(tǒng)。該系統(tǒng)由兩個(gè)載體組成：第一個(gè)載體表達(dá)Cas9基因，且不需要表達(dá)λ-RED重組酶，實(shí)際操作中不再需要誘導(dǎo)λ-RED重組酶的表達(dá)，簡(jiǎn)化了步驟流程；第二個(gè)載體表達(dá)sgRNA，并含有用于同源重組的同源臂序列。從而實(shí)現(xiàn)了基因編輯。本項(xiàng)成果的技術(shù)優(yōu)勢(shì)包括： （1）基因編輯時(shí)間由原有的20余天縮短到7-8天； （2）N個(gè)基因編輯時(shí)間由原有的N個(gè)月縮短到3+5N天； （3）無(wú)需表達(dá)λ-RED重組酶。                        圖1 鹽單胞菌TD01進(jìn)行基因編輯的流程示意圖02.應(yīng)用前景 本項(xiàng)成果可作為CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的載體，廣泛應(yīng)用于基因編輯領(lǐng)域。03.知識(shí)產(chǎn)權(quán) 本項(xiàng)成果已申請(qǐng)1項(xiàng)發(fā)明專利。04.團(tuán)隊(duì)介紹 本項(xiàng)目為多團(tuán)隊(duì)合作項(xiàng)目，其中一個(gè)團(tuán)隊(duì)的負(fù)責(zé)人為清華大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師，長(zhǎng)江學(xué)者特聘教授，國(guó)家杰出青年基金獲得者。主要研究方向?yàn)楹铣缮飳W(xué)、微生物代謝工程、生物材料、工業(yè)生物技術(shù)。已發(fā)表國(guó)內(nèi)外高水平學(xué)術(shù)論文數(shù)十篇，申請(qǐng)專利70余項(xiàng)。05.合作方式 投融資。06.聯(lián)系方式郵箱：zhangxinrui@tsinghua.edu.cn

一種家蠶滯育品種的低溫催青轉(zhuǎn)基因方法。用特殊的催青條件改變家蠶滯育品種下一代蠶卵的化性,使 特殊的催青條件下獲得的當(dāng)代家蠶滯育品種蠶蛾交配，產(chǎn)下非滯育的下一代蠶卵，最后參照非滯育家蠶卵胚 胎顯微注射的轉(zhuǎn)基因方法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因，從而巧妙地突破家蠶滯育品種轉(zhuǎn)基因技術(shù)的障礙并有效制作轉(zhuǎn)基因 蠶。該方法直接采用生產(chǎn)中普遍使用的實(shí)用性家蠶滯育品種作為原始材料，可以避免漫長(zhǎng)而煩瑣的育種過(guò) 程，直接利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)創(chuàng)造出各種性狀優(yōu)良的新的特殊家蠶品種，可大大縮短育種的周期，節(jié)約大量的人 力和物力。一種家蠶滯育品種的早期浸酸轉(zhuǎn)基因方法，利用在蠶卵胚胎發(fā)育至胚帶形成之前的一定時(shí)間內(nèi)， 即產(chǎn)卵后2個(gè)半小時(shí)之前對(duì)家蠶滯育卵進(jìn)行鹽酸的浸泡處理,隨后對(duì)處理解除滯育的蠶卵進(jìn)行風(fēng)臺(tái)顯微注射， 催青孵化獲得的GO代家蠶的飼養(yǎng)至化蛾，它們的自交或回交產(chǎn)生G1代，通過(guò)熒光標(biāo)記篩選，從而有效制作 轉(zhuǎn)基因家蠶。該方法直接采用生產(chǎn)中普遍使用的實(shí)用性家蠶滯育品種作為原始材料，可以避免漫長(zhǎng)而煩瑣的 育種過(guò)程,直接利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)創(chuàng)造出各種性狀優(yōu)良的新的特殊家蠶品種，可大大縮短育種的周期，節(jié)約大 量的人力和物力。

1. 痛點(diǎn)問(wèn)題 紅球菌是具有高抗逆性（耐有機(jī)溶劑、耐高溫、耐酸堿）的特殊放線菌，日本30年前首先使用紅球菌高效催化丙烯腈水合生產(chǎn)丙烯酰胺——其聚合產(chǎn)物廣泛用于石油開(kāi)采、水處理、土壤改良劑等領(lǐng)域——迄今為止仍是工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域最成功的案例之一。開(kāi)發(fā)紅球菌基因編輯方法，一方面可以實(shí)現(xiàn)紅球菌細(xì)胞自身性能的按需調(diào)控（如敲除副產(chǎn)物基因），解決丙烯酰胺、丙烯酸銨等酰胺、羧酸類大宗/精細(xì)化學(xué)品生產(chǎn)中的高成本和高排放問(wèn)題，另一方面有望以紅球菌細(xì)胞為普適性宿主，高表達(dá)各種外源功能酶，從而實(shí)現(xiàn)重組紅球菌全細(xì)胞催化技術(shù)的普遍應(yīng)用，尤其是解決手性醫(yī)藥中間體現(xiàn)有制備工藝中路線長(zhǎng)、工藝復(fù)雜、原子經(jīng)濟(jì)性差、環(huán)境污染嚴(yán)重等各種主要問(wèn)題。但是，作為一種革蘭氏陽(yáng)性放線菌，紅色紅球菌存在基因組中GC含量高、基因轉(zhuǎn)化率低、非法重組嚴(yán)重等問(wèn)題，基因組改造困難。目前紅色紅球菌基因組改造主要依賴于自殺質(zhì)粒介導(dǎo)的同源重組，但自殺質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率和單交換成功率很低，正確編輯率更低。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)高效的紅球菌基因組編輯工具。 2. 解決方案 本技術(shù)核心成果是一種基于CRISPR（成簇規(guī)律間隔短回文序列）-Cas9（DNA剪切蛋白）技術(shù)的紅色紅球菌基因組高效編輯方法。該技術(shù)通過(guò)紅色紅球菌特有啟動(dòng)子及質(zhì)粒元件，首先實(shí)現(xiàn)了Cas9蛋白在紅色紅球菌中的表達(dá)及切割功能；其次成功規(guī)避了紅球菌的限制修飾系統(tǒng)，將紅色紅球菌基因轉(zhuǎn)化效率提高了80多倍；接下來(lái)，又通過(guò)紅球菌重組酶的引入，顯著提高了外源基因在紅色紅球菌中的同源重組效率，最終率先成功建立紅色紅球菌的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，不僅可以實(shí)現(xiàn)基因組上目標(biāo)基因的敲除、替換和改造，也可實(shí)現(xiàn)多個(gè)基因的同時(shí)敲除以及無(wú)痕疊加敲除，為紅球菌全細(xì)胞催化平臺(tái)技術(shù)開(kāi)發(fā)及其在化學(xué)品綠色先進(jìn)制造中的應(yīng)用奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。 合作需求 開(kāi)展合作開(kāi)發(fā)、技術(shù)許可等，尋求有志于生物制藥、生物合成、石油開(kāi)采、日化洗滌等不同應(yīng)用領(lǐng)域進(jìn)行紅球菌全細(xì)胞催化法生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)品的企業(yè)合作，尤其是在上述不同領(lǐng)域具有生產(chǎn)和銷(xiāo)售優(yōu)勢(shì)或經(jīng)驗(yàn)的企業(yè)。

選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因作物已成為近年來(lái)植物基因工程技術(shù)研究的重點(diǎn)之一，隨著轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)品的商品化，轉(zhuǎn)基因植物的生物安全性受到公眾越來(lái)越多的關(guān)注，尤其是目前抗生素標(biāo)記基因在植物遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中的廣泛應(yīng)用，使人們對(duì)這些標(biāo)記基因可能帶來(lái)的潛在危害性心存疑慮，抗性標(biāo)記基因的存在嚴(yán)重地阻礙了轉(zhuǎn)基因植物的商品化進(jìn)程和轉(zhuǎn)化技術(shù)本身的有效性。 本項(xiàng)目培育的無(wú)抗生素標(biāo)記基因（可視化標(biāo)記基因）在建立高效、安全、規(guī)模化的轉(zhuǎn)基因作物技術(shù)體系方面取得突破，以紫色幼芽作為可視篩選標(biāo)記代替抗生素篩選標(biāo)記，構(gòu)建了新型轉(zhuǎn)化載體

本試驗(yàn)通過(guò)石蠟切片技術(shù)對(duì)湘軍金魚(yú)性腺組織進(jìn)行切片觀察，發(fā)現(xiàn)9月齡的雄性湘軍金魚(yú)精巢中有大量的成熟精子，11月齡的雌性湘軍金魚(yú)卵巢中有成熟卵子。 一、項(xiàng)目進(jìn)展 創(chuàng)意計(jì)劃階段 二、負(fù)責(zé)人及成員 姓名 學(xué)院/所學(xué)專業(yè) 入學(xué)/畢業(yè)時(shí)間 洪迪珊 湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/生物科學(xué) 2018/2022 陳雨薇 湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/生物技術(shù) 2018/2022 劉雨欣 湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/生物科學(xué) 2019/2023 馬彤彤 湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/生物科學(xué) 2019/2023 黃志嫻 湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/生物科學(xué) 2018/2022 三、指導(dǎo)教師 姓名 學(xué)院/所學(xué)專業(yè) 職務(wù)/職稱 研究方向 劉少軍 湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/魚(yú)類遺傳育種 教授 魚(yú)類遺傳育種 王余德 湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/魚(yú)類遺傳育種 講師 魚(yú)類遺傳育種 四、項(xiàng)目簡(jiǎn)介 為探究湘軍金魚(yú)的胚胎發(fā)育過(guò)程、能育性、倍性以及Chordin A基因在湘軍金魚(yú)的雙尾性狀形成過(guò)程中的作用，本試驗(yàn)通過(guò)石蠟切片技術(shù)對(duì)湘軍金魚(yú)性腺組織進(jìn)行切片觀察，發(fā)現(xiàn)9月齡的雄性湘軍金魚(yú)精巢中有大量的成熟精子，11月齡的雌性湘軍金魚(yú)卵巢中有成熟卵子。試驗(yàn)通過(guò)PHA體內(nèi)誘導(dǎo)腎細(xì)胞制片法對(duì)湘軍金魚(yú)染色體數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)其染色體數(shù)目為100條。試驗(yàn)通過(guò)PCR技術(shù)獲得了Chordin A基因全長(zhǎng)，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)Chordin A基因全2634 bp，其中堿基A共618個(gè)，占比23.46%、堿基C共692個(gè)，占比26.27%、堿基G共756個(gè)，占比28.70%、堿基共568個(gè)，占比21.56%。堿基“G+C”占比 54.97%，堿基“A+T”占比45.03%。試驗(yàn)對(duì)湘軍金魚(yú)不同組織進(jìn)行Chordin A基因的熒光定量PCR試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Chordin A基因在尾鰭表達(dá)量最高。項(xiàng)目成員在進(jìn)行科學(xué)探究的同時(shí)深挖湘軍金魚(yú)經(jīng)濟(jì)價(jià)值，項(xiàng)目組成員多次赴雙峰縣、龍?zhí)镦?zhèn)玉坪村等地進(jìn)行實(shí)地調(diào)研,我們發(fā)現(xiàn)觀賞魚(yú)行業(yè)是朝陽(yáng)行業(yè)，發(fā)展迅猛；與此同時(shí)湖南省休閑漁業(yè)來(lái)勢(shì)喜人，但是觀賞魚(yú)普遍魚(yú)病高發(fā)，變異物種破壞生態(tài)等問(wèn)題。本項(xiàng)目借助湘軍金魚(yú)這一優(yōu)質(zhì)魚(yú)種，通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)+農(nóng)副產(chǎn)品的銷(xiāo)售模式，變單一銷(xiāo)售模式為多形式利益聯(lián)合，拉動(dòng)當(dāng)?shù)氐慕?jīng)濟(jì)增長(zhǎng)。我們與村落達(dá)成了長(zhǎng)期合作的關(guān)系。湘軍金魚(yú)作為優(yōu)質(zhì)觀賞魚(yú)備受消費(fèi)者青睞。

可以量產(chǎn)/n該項(xiàng)目屬于作物標(biāo)記輔助育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及利用抗除草劑基因的油菜化學(xué)殺雄制種方法。本發(fā)明的特征包括培育耐受化學(xué)殺雄劑的父本材料和無(wú)遮擋的化學(xué)殺雄步驟。利用化學(xué)誘變劑誘變甘藍(lán)型油菜種子，在5-6葉期噴施除草劑苯磺隆，初步篩選得到抗除草劑的突變體材料，自交得到穩(wěn)定遺傳的抗除草劑油菜突變體株系，提取油菜突變體株系基因組DNA，擴(kuò)增得到BnaAHAS1和BnaAHAS3基因片段，其中BnaAHAS3基因片段的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示，在該基因BnaAHAS3第536bp處存在一個(gè)

中試階段/n該項(xiàng)目提供一種評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻水生環(huán)境安全性的方法，包括如下步驟：轉(zhuǎn)基因稻田和非轉(zhuǎn)基因稻田布置和管理；稻田水層和淤泥中外源蛋白的測(cè)定，包括樣本預(yù)處理和外源蛋白的抽提和測(cè)定；稻田水層中浮游生物的分離，包括水樣采集、沉淀分離浮游生物；稻田水層中浮游生物種類和豐度的測(cè)定，包括活體鑒定和數(shù)量計(jì)數(shù)；轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻的種植對(duì)浮游生物的安全性評(píng)價(jià)，利用分析軟件對(duì)浮游生物種類、數(shù)量、發(fā)生時(shí)期進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，得出多樣性指數(shù)、均勻性指數(shù)等參數(shù)，并和常規(guī)稻田進(jìn)行比較，從而對(duì)轉(zhuǎn)基因抗蟲(chóng)水稻水生環(huán)境安全性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

可以量產(chǎn)/n由于香石竹是乙烯敏感植物，在其采后貯藏運(yùn)輸期間需花費(fèi)大量的人力物力進(jìn)行保鮮處理。傳統(tǒng)的保鮮方法多采用含有乙稀抑制劑(如AVG、GVG、AOA)和乙稀拮抗劑(如AgNO3、STS、2,5-NBD)的保鮮劑，或是利用冷藏、氣調(diào)等措施，不僅成本高，效果也不盡人意，且易造成環(huán)境污染。本成果運(yùn)用轉(zhuǎn)基因沉默理論，通過(guò)基因工程的方法抑制香石竹內(nèi)源乙烯的生物合成，從而達(dá)到延長(zhǎng)香石竹自然保鮮期的目的，進(jìn)而達(dá)到有效調(diào)節(jié)貯運(yùn)和香石竹市場(chǎng)供應(yīng)之目的。技術(shù)水平：利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得了瓶插壽命明顯延長(zhǎng)的香石竹切花'M

研發(fā)階段/n基于基因組定點(diǎn)編輯分子育種新技術(shù)及其配套軟件。　　成果簡(jiǎn)介：本成果含有完整的基于CRISPR/Cas系統(tǒng)介導(dǎo)的基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)，我們對(duì)基因組編輯技術(shù)切割活性和脫靶效應(yīng)進(jìn)行了優(yōu)化，開(kāi)發(fā)了完整的sgRNA設(shè)計(jì)，sgRNA表達(dá)載體構(gòu)建，細(xì)胞或在體水平基因組打靶和脫靶檢測(cè)等技術(shù)。提高基因組定點(diǎn)打靶效率和降低脫靶風(fēng)險(xiǎn)，為基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)應(yīng)用于動(dòng)植物分子育種打開(kāi)了新的局面。本成果擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的基因組編輯技術(shù)配套軟件，其適用于針對(duì)不同物種基因組設(shè)計(jì)和篩選活性高，特異性強(qiáng)的sgRNA用于動(dòng)植物分

全面開(kāi)發(fā)了生脈散抑制 ras 原癌基因過(guò)表達(dá)中 的新用途，具體涉及在制備抑制 ras 原癌基因過(guò)表達(dá)的抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。