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高效脂肪酶催化制備脂溶性維生素關(guān)鍵技術(shù)及產(chǎn)業(yè)化

一種杜仲eu-Hmgr蛋白編碼序列，屬于基因工程領(lǐng)域。所分離出的DNA分子包括：編碼具有杜仲eu-Hmgr蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第170-1952位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在40-55℃條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸第170-1952位的核苷酸序列雜交。本發(fā)明是一種3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A的還原酶，有助于提高杜仲中次生代謝產(chǎn)物或其前體的含量，次生代謝產(chǎn)物具有雙向調(diào)節(jié)人體血壓的作用，并可降低人體膽固醇含量，預(yù)防心腦血管硬化等功能。對(duì)于保護(hù)人民的健康生長(zhǎng)有所幫助。

隨著首個(gè)RNA修飾N6-甲基腺嘌呤（m6A）的去修飾酶FTO的發(fā)現(xiàn)，RNA表觀遺傳學(xué)/表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)開始興起并成為表觀遺傳學(xué)新的研究熱點(diǎn)。m6A作為首個(gè)被發(fā)現(xiàn)的可逆RNA修飾，廣泛存在于mRNA，依賴修飾酶、去修飾酶和結(jié)合蛋白發(fā)揮調(diào)控功能。已發(fā)現(xiàn)m6A具有調(diào)控mRNA剪接、出核、穩(wěn)定性和蛋白翻譯等功能，可以參與發(fā)育、配子發(fā)生、細(xì)胞重編程、生物節(jié)律、疾病等多種生理和病理過程的功能調(diào)控。為了更好地研究m6A生物功能和臨床病理研究，開發(fā)m6A高通量測(cè)序技術(shù)一直是研究的熱點(diǎn)。 現(xiàn)有m6A測(cè)序技術(shù)主要依賴于m6A抗體富集技術(shù)，包括低分辨率的m6A-seq/MeRIP-seq和聯(lián)用iCLIP或PAR-CLIP技術(shù)的高分辨率m6A測(cè)序技術(shù)miCLIP 或PA-m6A-seq。抗體存在對(duì)特定RNA序列或結(jié)構(gòu)的潛在非特異性結(jié)合，為了解決抗體方法的種種問題，研究者們做出了各種嘗試，近期開發(fā)了兩類無(wú)需抗體的m6A測(cè)序技術(shù)，一類為利用對(duì)特定甲基化序列（m6ACA）敏感的RNA核酸內(nèi)切酶MazF輔助的測(cè)序方法（m6A-REF-seq or MAZTER-seq），此類方法只能檢測(cè)16~25%的m6A位點(diǎn)；另一種是在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)融合m6A-binding domain（YTH）與胞嘧啶脫氨酶（APOBEC1）的融合蛋白實(shí)現(xiàn)的m6A測(cè)序（DART-seq），但該方法依賴于細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率且受限于體外樣品的使用。 賈桂芳課題組一直致力于開發(fā)和利用核酸化學(xué)生物學(xué)技術(shù)研究RNA化學(xué)修飾在動(dòng)植物中的生物功能研究。在本課題中，賈桂芳課題組巧妙地利用m6A的去甲基酶FTO蛋白作為催化劑，將mRNA上化學(xué)惰性的m6A轉(zhuǎn)化為高反應(yīng)活性的中間態(tài)產(chǎn)物N6-羥甲基腺嘌呤（hm6A），然后利用二硫蘇糖醇（DTT）的巰基與hm6A發(fā)生亞胺1,2加成反應(yīng)，將不穩(wěn)定的hm6A轉(zhuǎn)化為更穩(wěn)定的巰基加成產(chǎn)物dm6A。dm6A上的自由巰基可以與甲烷硫代磺酸（methanethiosulfonate，MTSEA）快速反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)在mRNA上m6A的位置標(biāo)記生物素Biotin，最終可被鏈霉親和素珠捕獲，從而富集含有m6A修飾的RNA片段供后續(xù)高通量測(cè)序使用。

蛋白酶體是細(xì)胞用來(lái)調(diào)控特定蛋白質(zhì)的濃度和清除錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的主要機(jī)制，是細(xì)胞中最普遍的不可或缺的大型 蛋白復(fù)合機(jī)器之一，也是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最大的蛋白降解機(jī)器。 蛋白酶體全酶是由蓋子 (Lid)和基座(Base)亞復(fù) 合體組成的調(diào)控顆粒RP(Regulatory Particle)所激活。基座亞復(fù)合體在組裝過程中最重要的一個(gè)步驟是異質(zhì)六 聚AAA-ATPase環(huán)的組裝。這個(gè)過程至少需要被PAAF1, p28/gankyrin, p27/PSMD9和S5b這四種調(diào)控顆粒(RP)組 裝伴侶蛋白分子所引導(dǎo)。天然的自由態(tài)19S調(diào)控復(fù)合體的構(gòu)象存在大量的亞穩(wěn)定態(tài)，并表現(xiàn)出大幅度的局部構(gòu)象漲 落，使冷凍電子顯微鏡技術(shù)成為解析其結(jié)構(gòu)的唯一手段。利用 冷凍電鏡解析人源蛋白酶體全酶的基礎(chǔ)上（見PNAS 2016, 113: 12991-12996），利用他們自主開發(fā)的基于統(tǒng)計(jì) 流行算法的高性能計(jì)算軟件ROME（見PLoS ONE 2017, 12:e0182130）與優(yōu)化的冷凍電鏡處理方法對(duì)p28-RP復(fù)合 體細(xì)微動(dòng)態(tài)構(gòu)象進(jìn)行深度分類，共解析出了1個(gè)4.5-? p28綁定的調(diào)控顆粒（RP）非AAA的亞復(fù)合體，3個(gè)近7-? p28 綁定的完整RP結(jié)構(gòu)，1個(gè)亞納米精度下的非p28綁定的完整RP結(jié)構(gòu)以及7個(gè)亞納米精度下的由Rpn1-p28-AAA組成的p28 綁定RP的亞復(fù)合體的動(dòng)態(tài)構(gòu)象。觀察到自由態(tài)RP調(diào)控顆粒中p28-綁定的AAA環(huán)并沒有組成的閉 環(huán)孔狀通道，而是自發(fā)地在Rpt2-Rpt6和Rpt3-Rpt4界面上形成多個(gè)由“開”到“關(guān)”的拓?fù)渥儤?gòu)。

本項(xiàng)目涉及一種新型的超級(jí)糖胺聚糖裂解酶 HCLase. 通過對(duì)提取的外周血基因組 DNA 與目的基因 GSTM3 啟動(dòng)子的甲基化特異 性引物對(duì)和探針、內(nèi)參基因 ALU-C4 的特異性引物對(duì)和 Taqman 熒光探針序列， 對(duì)處理過的 DNA 進(jìn)行實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)剑≒CR）反應(yīng),用甲基化特異性 PCR 205 的方法檢測(cè)目的基因 GSTM3 和內(nèi)參基因 ALU-C4 的閾值循環(huán)值，并計(jì)算出基 因 GSTM3 甲基化定量值。有助于評(píng)估病情、判斷預(yù)后及指導(dǎo)治療。

研發(fā)階段/n本成果合成了人工免疫原和包被原，制備出高效價(jià)的特異性抗體，建立了肌肉(豬、雞、魚)、肝臟(豬、雞)、腎臟(豬)中AOZ殘留檢測(cè)的ELISA方法，并與建立的多殘留檢測(cè)HPLC方法進(jìn)行了對(duì)比。該方法的檢測(cè)限、回收率、變異系數(shù)均達(dá)到我國(guó)獸藥殘留快速檢測(cè)的要求。以上述方法為基礎(chǔ)，在國(guó)內(nèi)首次研制出動(dòng)物樣品中AOZ殘留檢測(cè)ELISA試劑盒。通過與國(guó)外同類試劑盒、HPLC法的比對(duì)和動(dòng)物殘留試驗(yàn)證明，該試劑盒的靈敏度、準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性與國(guó)外試劑盒水平相當(dāng)。經(jīng)多家檢測(cè)機(jī)構(gòu)和研究單位的復(fù)核和應(yīng)用表明，該試劑盒

研發(fā)階段/n本發(fā)明公開了一種從高效表達(dá)的基因工程菌中提取重組黃曲霉尿酸氧化酶的方法。該菌是攜帶重組質(zhì)粒的大腸桿菌Rosetta(DE3)，該重組質(zhì)粒是含黃曲霉尿酸氧化酶uricase基因的質(zhì)粒pET-30c(+)。用該菌生產(chǎn)黃曲霉尿酸氧化酶的方法包括四個(gè)步驟：A、工程菌發(fā)酵，累積胞內(nèi)尿酸氧化酶；B、超聲波破胞，離心收集上清液（含可溶性尿酸氧化酶）；C、依次進(jìn)行離子交換層析、疏水層析及凝膠過濾層析，收集活性峰；D、將活性峰冷凍干燥，即得高純度的重組黃曲霉尿酸氧化酶。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：生產(chǎn)重組黃曲霉尿酸氧化

近日，東南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院、江蘇省富碳材料器件工程研究中心張?jiān)〗淌趫F(tuán)隊(duì)（https://carbosensing.group）在Fe-N-C納米酶在催化抗壞血酸氧化反應(yīng)中的機(jī)制研究取得進(jìn)展，相關(guān)成果以“Insights into Iron Leaching from an Ascorbate-Oxidase-like Fe-N-C Nanozyme and Oxygen Reduction Selectivity”為題在化學(xué)領(lǐng)域國(guó)際權(quán)威學(xué)術(shù)期刊Angew. Chem. Int. Ed.以VIP Paper形式在線發(fā)表。

本發(fā)明公開了一種海洋黑曲霉生產(chǎn)耐鹽纖維素酶的液體發(fā)酵方法。包括如下步驟:1)從東海近海10～20m深處的泥土里篩選得到一株海洋黑曲霉;2)海洋黑曲霉接種于PDA培養(yǎng)基上,32～40℃下培養(yǎng)60～90小時(shí),得到斜面孢子,斜面孢子保藏于4℃;3)斜面孢子接種于PDA-1培養(yǎng)基,在32～40℃下培養(yǎng)60～90h,得到活化的孢子;4)活化的孢子接種于茄子瓶斜面,42℃培養(yǎng)74小時(shí),得到擴(kuò)培的茄子瓶斜面孢子;5)擴(kuò)培得到的茄子瓶斜面孢子用滅菌人工海水稀釋到108個(gè)孢子/ml,接種于液體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基,發(fā)酵5～10天,得到纖維素酶。本發(fā)明具有產(chǎn)酶活高、酶穩(wěn)定、耐鹽性好等優(yōu)點(diǎn),生產(chǎn)的纖維素酶可以在較高鹽含量的條件下降解纖維素,為該水解物的后續(xù)應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

(R)-硫辛酸是一種能消除老化與致病的類似維他命的物質(zhì)，可以去除機(jī)體自由基，促進(jìn)機(jī)體利用葡萄糖合成維生素C，能有效去除黑色素，還可協(xié)助輔酶進(jìn)行有利于機(jī)體免疫力的生理代謝，是一種萬(wàn)能抗氧化劑藥物，廣泛應(yīng)用于預(yù)防和治療心臟病、糖尿病及老年癡呆癥。而近年來(lái)歐美國(guó)家開始將其應(yīng)用于食品、保健品及化妝品，應(yīng)用范圍的擴(kuò)展為其市場(chǎng)增長(zhǎng)提供了廣闊的空間。目前 (R)-硫辛酸的生產(chǎn)主要是通過化學(xué)拆分法合成 (化學(xué)拆分法合成途徑) ，即先通過化學(xué)法合成混旋硫辛酸，再利用苯乙胺作為拆分劑對(duì)其進(jìn)行拆分，得到的右旋硫辛酸苯乙胺鹽，經(jīng)鹽酸脫鹽得到 (R)-硫辛酸粗品，精制后即可得到合格的 (R)-硫辛酸。但由于該法工藝復(fù)雜，需要多次結(jié)晶，成本高、理論得率僅為50%。 本技術(shù)利用酶法不對(duì)稱還原8-氯-6-羰基辛酸乙酯制備 (S)-8-氯-6-羥基辛酸乙酯，再結(jié)合化學(xué)法合成 (R)-硫辛酸的工藝路線 (化學(xué)-酶法合成途徑) ，可使 (R)-硫辛酸的合成步驟由化學(xué)-拆分法的9步縮減到化學(xué)-酶法的6步、產(chǎn)品收率提高40%、生產(chǎn)成本降低20%，而且也顯著地減少了原料消耗和廢物排放，是典型的環(huán)境友好的綠色合成工藝。合成的最終產(chǎn)品 (R)-硫辛酸的光學(xué)純度在99%以上，其產(chǎn)業(yè)化更具有經(jīng)濟(jì)效益、更符合綠色技術(shù)的要求。