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量子相干控制超分辨熒光寬場(chǎng)顯微成像

傳統(tǒng)的光學(xué)顯微系統(tǒng)受到阿貝衍射極限原理的限制，無(wú)法分辨尺度小于~200nm的事物，為了突破衍射極限，超分辨熒光顯微技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，在生物成像等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。根據(jù)成像采集過(guò)程，超分辨方法主要可分為兩類。一種是單分子定位顯微方法（SMLM），通過(guò)熒光分子的光開(kāi)關(guān)特性，孤立每個(gè)發(fā)光分子進(jìn)行單獨(dú)定位。此類方法具有不受衍射極限限制的特點(diǎn)，可以得到10-40nm的超高分辨率，但由于分子激活漂白的循環(huán)步驟使得采集速度和成像時(shí)間較慢。另一種是如結(jié)構(gòu)光照明等寬場(chǎng)成像的超分辨顯微技術(shù)，可以通過(guò)獲得相鄰區(qū)域/熒光分子間一定程度的響應(yīng)差異來(lái)實(shí)現(xiàn)分辨率的提升。寬場(chǎng)成像的方法具有較高的時(shí)間采集效率，但由于同時(shí)激發(fā)視野內(nèi)的全部分子，使得其分辨能力往往在100nm以上。目前還缺乏一種方法在理論上可以有效的兼顧寬場(chǎng)成像的時(shí)間采集效率和單分子定位方法的空間分辨率，因此亟需提出一種基于寬場(chǎng)成像對(duì)熒光分子高效調(diào)制的技術(shù)方案。超分辨方法其本質(zhì)都是通過(guò)識(shí)別單個(gè)熒光分子的獨(dú)立的發(fā)射特性獲得該分子的空間定位。如果可以對(duì)寬場(chǎng)成像中衍射極限以內(nèi)各個(gè)發(fā)光分子熒光發(fā)射差異實(shí)現(xiàn)主動(dòng)控制，則有可能獲得更好的超分辨顯微結(jié)果。近期，物理學(xué)院介觀物理國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室極端光學(xué)研究團(tuán)隊(duì)提出了基于量子相干控制原理主動(dòng)調(diào)制分子熒光發(fā)射而獲得超分辨熒光顯微的方法（SNAC），在寬場(chǎng)成像下實(shí)現(xiàn)了分辨率的提升。課題組在ZnCdS量子點(diǎn)體系下獲得衍射極限范圍內(nèi)各個(gè)量子點(diǎn)的差異化激發(fā)。通過(guò)設(shè)計(jì)多個(gè)整形脈沖，單個(gè)ZnCdS量子點(diǎn)的熒光差異性會(huì)得到增強(qiáng)。課題組通過(guò)周期性改變整形脈沖和傅立葉增強(qiáng)提取熒光響應(yīng)的差異。同時(shí)，主動(dòng)控制的圖像采集方案可以有效的抑制系統(tǒng)中不隨調(diào)制周期變化的泊松隨機(jī)噪聲和CMOS工藝導(dǎo)致的固定噪聲，極大的提升了信噪比。接著，利用獨(dú)立開(kāi)發(fā)的混合周期（Combination-FFT）和多高斯擬合定位算法獲得最終的超分辨重建結(jié)果。研究模擬了鄰近雙點(diǎn)熒光發(fā)射的超分辨定位，其結(jié)果可以很好的分辨出低至50nm的相鄰熒光分子。對(duì)于密集標(biāo)記的線性結(jié)構(gòu)，SNAC的分辨能力同樣有顯著性的提高，獲得了30nm左右的徑向定位精度。在量子點(diǎn)標(biāo)記的COS7細(xì)胞樣品的維管結(jié)構(gòu)區(qū)域清晰的觀測(cè)到了維管的平行取向和姿態(tài)排布以及纖維交叉區(qū)域的95.3nm的鄰近雙峰，顯示出了比已有多種寬場(chǎng)超分辨方法更好的重建結(jié)果。這個(gè)研究將脈沖整形作為新的控制維度引入熒光超分辨，并將寬場(chǎng)超分辨成像技術(shù)的分辨率提升到了與單分子定位方法接近的50nm的水平。

北京大學(xué) 2021-04-11

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