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本研究將構(gòu)建重組溶瘤腺病毒，以期達(dá)到治療實(shí)體腫瘤（肝癌）的目的。在腫瘤局部，利用溶瘤腺病毒誘導(dǎo)的炎癥引起免疫細(xì)胞浸潤。同時(shí)病毒可以感染并裂解腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)致腫瘤相關(guān)抗原釋放。而重組溶瘤腺病毒可以同時(shí)使被感染的細(xì)胞表達(dá)免調(diào)控融合蛋白PD1CD137L，在活化T 細(xì)胞的同時(shí)封閉腫瘤表面PD-L1 傳遞的負(fù)向信號(hào)。最終使得機(jī)體的免疫細(xì)胞能夠識(shí)別腫瘤抗原，并產(chǎn)生特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答，最終達(dá)到清除腫瘤的目的。

精氨酸脫亞胺酶（Arginine deiminase，EC 3.5.3.6，ADI）因其可以作為 精氨酸營養(yǎng)缺陷型腫瘤細(xì)胞（如：肝癌、黑素瘤）的靶向治療藥物而受到廣泛關(guān)注。目前，進(jìn)入癌癥臨床研究的僅有支原體來源的 ADI，處于臨床三期試驗(yàn)。本項(xiàng)目從自然界篩選到產(chǎn)精氨酸脫亞胺酶的變形假單胞菌，在大腸桿菌實(shí)現(xiàn) 了該酶的重組表達(dá)，采用該重組 ADI 進(jìn)行體外和小鼠體內(nèi)抗癌活性研究，對(duì)肝癌細(xì)胞人肝癌細(xì)胞系 HepG2 和小鼠肝癌細(xì)胞系 H22 有顯著抑制作用。基于簡(jiǎn)便靈敏的 96 孔板高通量篩選模型，篩選在體內(nèi)生理?xiàng)l件下具有較高酶活以及底物親和性的精氨酸脫亞胺酶突變株，采用隨機(jī)突變、定點(diǎn)突變等非理性和半理性的蛋白質(zhì)定向進(jìn)化手段，獲得了最適 pH 由 6.0 提高至 7.0，在生理中性條件下（pH 7.4）酶活力較野生型 ADI 提高了 33 倍以上的 ADI 突變株，比活力為 15－17 U/mg。該改造后的 ADI 的 PEG 化和小鼠實(shí)驗(yàn)正在進(jìn)行中。 

通過檢測(cè)少量血液中ctDNA特定位點(diǎn)甲基化水平，對(duì)肝癌進(jìn)行早期診斷及療效和預(yù)后預(yù)測(cè)的新方法。ctDNA相當(dāng)于腫瘤細(xì)胞釋放到血液中的身份指紋，由于其攜帶有與原發(fā)腫瘤相一致的甲基化改變，理論上可以利用ctDNA的甲基化譜對(duì)腫瘤進(jìn)行診斷，這一被稱為“液體活檢”（Liquid Biopsy）的新技術(shù)已經(jīng)成為當(dāng)前腫瘤研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。但是，ctDNA在血液中的含量極微，每毫升血中僅有約20ng，相當(dāng)于一滴水的一億分之一，并且混雜在更大量的正常游離DNA背景中，在這么微量的ctDNA中檢測(cè)單個(gè)堿基的甲基化水平，好比在機(jī)場(chǎng)和火車站的數(shù)百萬人流中找到個(gè)別犯罪分子，其難度可想而知。?先后攻克了穩(wěn)定提取微量ctDNA、提高重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化效率、靶向甲基化PCR擴(kuò)增及測(cè)序、海量數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理等一個(gè)個(gè)技術(shù)壁壘，終于從40多萬個(gè)候選位點(diǎn)中分別尋找到10個(gè)早期診斷和療效相關(guān)以及8個(gè)預(yù)后相關(guān)的位點(diǎn)，就像是破獲了肝癌的“身份指紋”，讓早期的肝癌病灶也無所遁形，實(shí)現(xiàn)肝癌早診早治技術(shù)的關(guān)鍵突破。

研發(fā)背景：糖尿病和老年癡呆癥（Alzheimer’s disease, 簡(jiǎn)稱 AD）是目前影響人類健康和社會(huì)發(fā)展的重大疾病。糖尿病和AD之間存在密切聯(lián)系，因此AD也被某些研究者稱為三型糖尿病。目前AD無藥可治；而糖尿病已經(jīng)有了很多的“血糖控制”藥物。然而，糖尿病的真正危害不是高血糖，而是高血糖相關(guān)的糖尿病并發(fā)癥。最新的研究表明，目前方式的嚴(yán)格血糖控制并不能給大多數(shù)病人帶來降低糖尿病并發(fā)癥的收益；相反，此類血糖控制可能帶來低血糖和死亡率升高的風(fēng)險(xiǎn)。因此，美國醫(yī)師協(xié)會(huì)(ACP)建議：大多數(shù) 2 型糖尿病患者的控制目標(biāo)應(yīng)該是糖化血紅蛋白水平在7~8%之間（即平均血糖在8~11mM 范圍）。而這一理想控糖并降低糖尿病并發(fā)癥的目標(biāo)可由釩配合物藥物實(shí)現(xiàn)。 抗糖尿病釩配合物曾經(jīng)在2009年前在美國進(jìn)入二期臨床研究。但由于美國金融危機(jī)影響和當(dāng)時(shí)測(cè)試的釩配合物BEOV的潛在腎臟副作用，BEOV的開發(fā)在2009年終止。本研究室從2009年通過長期研究，成功解析了釩配合物藥理作用和毒理作用的分子機(jī)制，通過理性藥物設(shè)計(jì)，得到了VOdmada等系列新型具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的配合物，有效解決了以前釩配合物存在的問題。在多種二型糖尿病動(dòng)物上具有良好的控糖和預(yù)防并發(fā)癥的療效，并且明顯延長了動(dòng)物的壽命。而在APPS1動(dòng)物模型上，則能夠有效抑制淀粉樣蛋白對(duì)腦組織的損傷，成功維持動(dòng)物的記憶和認(rèn)知水平。 前景預(yù)測(cè)：VOdmada有望開發(fā)成功為I類口服抗糖尿病（而非僅僅控糖）新藥，以及I類口服抗AD新藥。開發(fā)策略可根據(jù)市場(chǎng)及FDA政策擇優(yōu)選擇。 成果特點(diǎn)：VOdmada釩配合物抗糖尿病藥物和已有的口服控糖藥物相比。現(xiàn)有藥物均以胰島素及其信號(hào)通路為靶點(diǎn)，而釩配合物的抗糖尿病作用則以調(diào)節(jié)細(xì)胞應(yīng)激響應(yīng)為起點(diǎn)，發(fā)揮多種作用，主要包括：激活Hsp60-PPARγ-AMPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，發(fā)揮胰島素增敏和促進(jìn)腦、肌肉、脂肪、肝臟等組織的葡萄糖/脂肪代謝的作用。在此方面，釩配合物的作用相當(dāng)于現(xiàn)有的藥物二甲雙胍和吡格列酮聯(lián)用；調(diào)節(jié)未折疊蛋白響應(yīng)，促進(jìn)Grp78表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)胰島細(xì)胞和促進(jìn)胰島細(xì) 胞恢復(fù)的作用；調(diào)節(jié)線粒體應(yīng)激，促進(jìn)Grp75表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞作用；減肥和壽命延長作用（藥理分子機(jī)制有待闡釋）。

本項(xiàng)目擬研發(fā)腫瘤特異熒光增強(qiáng)核酸遞送體系，該體系的制備及產(chǎn)業(yè)化將有助于開發(fā)原發(fā)性肝癌早期診斷的新材料和新方法，提供腫瘤的熒光成像及術(shù)中導(dǎo)航的新產(chǎn)品和新思路。

本項(xiàng)目提供了一種靶向肝癌細(xì)胞的納米藥物（LTAG-NPs）。該藥 物以天然多糖搭載臨床廣泛使用的鉑類抗癌藥物，具有合成簡(jiǎn)便，成 分友好的特點(diǎn)，通過與肝（癌）細(xì)胞發(fā)生特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)肝癌靶向 效果。藥物在肝部高效富集并在腫瘤細(xì)胞中釋藥。因此，LTAG-NPs 在有效抑制腫瘤生長的同時(shí)，明顯降低傳統(tǒng)化療藥物強(qiáng)烈的毒副作用， 提高患者順從度和安全性。具有較高臨床應(yīng)用價(jià)值和轉(zhuǎn)化前景。 體外釋藥實(shí)驗(yàn)表明，在腫瘤細(xì)胞環(huán)境下，LTAG-NPs 4 小時(shí)釋放 藥物超過 20%，6 天藥物全部釋放，既在 6 天內(nèi)緩慢持續(xù)釋藥；藥物 代謝實(shí)驗(yàn)證明，LTAG-NPs 在注射小鼠體內(nèi) 24 h 后仍保持較高藥物 濃度，具有血液長循環(huán)效果；生物分布實(shí)驗(yàn)證明，納米藥物在肝部的 富集是傳統(tǒng)化療藥物的 5-6 倍，明顯降低了在腎臟的積累；對(duì)于同時(shí) 種有肝異位瘤和肺異位瘤的小鼠，LTAG-NPs 在肝異位瘤的富集量為 肺異位瘤的 2.5 倍，說明具有優(yōu)異的肝腫瘤靶向能力。體內(nèi)抑瘤實(shí)驗(yàn) 證明，納米藥物具有與傳統(tǒng)化療藥物相當(dāng)?shù)囊至鲂Ч靖弊饔妹黠@ 降低，尤其是明顯降低了腎毒性。大劑量注射傳統(tǒng)化療藥物的小鼠在 5 天內(nèi)全部死亡，而納米藥物組則保持存活率 100%，且小鼠體重穩(wěn) 步上升，體征良好。 以上動(dòng)物實(shí)驗(yàn)全部由醫(yī)院完成并進(jìn)行相關(guān)評(píng)價(jià)

 高志良教授團(tuán)隊(duì)與雙聘教授鄺棟明教授團(tuán)隊(duì)合作，在“十三五”國家科技重大專項(xiàng)和國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目等基金的支持下，發(fā)現(xiàn)了PD-L1+肝癌免疫微環(huán)境存在高度的異質(zhì)性。研究證實(shí)巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞釋放的炎性介質(zhì)均參與了PD-L1+肝癌形成，但巨噬細(xì)胞同時(shí)賦予了PD-L1+肝癌可抵抗傳統(tǒng)化療、T細(xì)胞殺傷和免疫檢查點(diǎn)治療的特征。聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)治療和巨噬細(xì)胞功能調(diào)控有望成為新型的肝癌治療策略。同時(shí)，上述主體研究結(jié)論同時(shí)在多種人類腫瘤中得到驗(yàn)證。

肝癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）是全球第五大常見的消化道惡性腫瘤，也是全球第三大致死性癌癥。我國肝癌病發(fā)率位居全球首位，肝癌已成為嚴(yán)重威脅我國人民健康和生命的疾病。由于肝癌的早期診斷缺乏可靠的生物標(biāo)志物，肝癌患者通常在肝癌晚期才被診斷，其5年生存率僅為15%。目前肝癌診斷主要依賴于影像學(xué)檢查或者血液活檢中的甲胎蛋白（AFP）標(biāo)志物等手段。但這些傳統(tǒng)方法對(duì)于癌變?cè)缙诖嬖诿舾行缘汀⑻禺愋缘偷染窒扌裕纾夯顧z中的甲胎蛋白特異性差，且往往到癌癥晚期才能檢測(cè)到其含量升高，可能延誤最佳的治療時(shí)機(jī)。因此亟需找到一種可用于肝癌診斷及預(yù)后的可靠的新型液體活檢標(biāo)志物。 液體活檢為一門新型的檢測(cè)技術(shù)，越來越受到關(guān)注。目前可以作為無創(chuàng)檢測(cè)的生物標(biāo)志物大多數(shù)是蛋白質(zhì)分子和DNA分子，但這些標(biāo)志物在靈敏度、誤診率和經(jīng)濟(jì)成本高等方面的缺陷導(dǎo)致它們很難被普及。RNA分子在細(xì)胞中擁有多個(gè)拷貝并且存在多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控形態(tài)，可以更加準(zhǔn)確地反映細(xì)胞狀態(tài)和癌癥動(dòng)態(tài)發(fā)展過程，而且其檢測(cè)成本也很低。 過去體液中的RNA標(biāo)志物研究主要集中在miRNA等小RNA的研究，相對(duì)于細(xì)胞中大量的長RNA，miRNA的數(shù)量要少一個(gè)到兩個(gè)數(shù)量級(jí)，因此提供的信息也有限。本項(xiàng)目另辟蹊徑，通過對(duì)大量肝癌患者（HCC）、慢性乙型肝炎患者(CHB)和健康個(gè)體(HD)進(jìn)行血漿中非編碼RNA表達(dá)譜的高通量測(cè)序檢測(cè)和分析，發(fā)現(xiàn)了一種非編碼RNA，srpRNA (RN7SL1)，的功能結(jié)構(gòu)域可以穩(wěn)定存在于血液中，并在區(qū)分肝癌患者和陰性對(duì)照組時(shí)具有良好的敏感度和特異性（約90%）。并且，通過在獨(dú)立驗(yàn)證集上的實(shí)時(shí)熒光定量檢驗(yàn)（RT-qPCR），該srpRNA (RN7SL1)的功能結(jié)構(gòu)域被證明在 肝癌的診斷及預(yù)后方面都具有可靠的臨床表現(xiàn)。

項(xiàng)目成果/簡(jiǎn)介:肝癌（Hepatocellular carcinoma, HCC）是全球第五大常見的消化道惡性腫瘤，也是全球第三大致死性癌癥。我國肝癌病發(fā)率位居全球首位，肝癌已成為嚴(yán)重威脅我國人民健康和生命的疾病。由于肝癌的早期診斷缺乏可靠的生物標(biāo)志物，肝癌患者通常在肝癌晚期才被診斷，其5年生存率僅為15%。目前肝癌診斷主要依賴于影像學(xué)檢查或者血液活檢中的甲胎蛋白（AFP）標(biāo)志物等手段。但這些傳統(tǒng)方法對(duì)

課題組對(duì)六例多灶肝癌患者共34個(gè)病灶進(jìn)行了高深度全外顯子測(cè)序，發(fā)現(xiàn)多灶肝癌大部分來源于肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，共享部分突變；進(jìn)一步的進(jìn)化樹分析顯示每個(gè)病灶又呈現(xiàn)出相對(duì)獨(dú)立的克隆進(jìn)化模式，且僅有20%靶向藥物的作用靶點(diǎn)位于進(jìn)化樹的樹干，即為所有病灶所共有，其中，僅有一位患者的索拉非尼敏感靶點(diǎn)位于進(jìn)化樹的樹干，提示該患者所有病灶理論上可對(duì)索拉非尼治療產(chǎn)生應(yīng)答，從而揭示了多灶肝癌因克隆進(jìn)化引起的藥物靶點(diǎn)分布不均的特點(diǎn)，為預(yù)防多灶肝癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的精準(zhǔn)靶向治療提供了理論依據(jù)。       同時(shí)，該研究通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)首次分析了多灶肝癌免疫微環(huán)境的差異，發(fā)現(xiàn)即使是同一患者，不同病灶浸潤的免疫細(xì)胞成分及數(shù)量均存在明顯差異。基于特征性免疫相關(guān)基因的表達(dá)水平進(jìn)行無監(jiān)督聚類分析，可將病灶分為高免疫和低免疫兩種亞型，并觀察到高免疫性腫瘤同時(shí)伴有PD1等抑制性免疫分子的高表達(dá)，提示此類患者更可能從PD1單抗治療中獲益，為肝癌免疫治療獲益人群的篩選提供了依據(jù)。