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項(xiàng)目成果/簡(jiǎn)介: 抗菌肽( Antibacterial peptides) 是由動(dòng)植物細(xì)胞內(nèi)特定基因編碼，經(jīng)外界條件誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類(lèi)對(duì)細(xì)菌、真菌及病毒等微生物具有殺傷作用的多肽?？咕牟煌诳股氐淖饔脵C(jī)制?？咕膶?duì)細(xì)菌、真菌、病毒和腫瘤等均有作用，尤其對(duì)耐藥性細(xì)菌有殺滅作用，具有廣譜性。 本項(xiàng)目主要涉及4種不同來(lái)源抗菌肽工程菌株以及生產(chǎn)工藝。具體為：美洲擬鰈抗菌肽Pleurocidin、果蠅抗菌肽Metchnikowin、假黑盤(pán)菌抗菌肽-菌絲霉素Plectasin以及梭魚(yú)娃2-RPLX等4種抗菌肽發(fā)酵生產(chǎn)工程菌株及菌株高效發(fā)酵生產(chǎn)工藝。 技術(shù)指標(biāo)（創(chuàng)新要點(diǎn)等）： 1. 抗菌肽工程菌株的構(gòu)建 2. 抗菌肽的分離純化以及活性鑒定； 3. 抗菌肽發(fā)酵生產(chǎn)工藝參數(shù)及流程。 抗菌肽的生物活性主要有抑制或殺滅細(xì)菌作用、抗真菌作用、抗病毒活性、抗寄生蟲(chóng)作用、免疫調(diào)節(jié)作用以及抑制或殺傷腫瘤細(xì)胞作用。目前主要應(yīng)用領(lǐng)域包括但不限于作為抗生物替代品用于醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)、飼料工業(yè)、食品工業(yè)。知識(shí)產(chǎn)權(quán)類(lèi)型:生物醫(yī)藥新品種技術(shù)先進(jìn)程度:達(dá)到國(guó)內(nèi)先進(jìn)水平成果獲得方式:獨(dú)立研究獲得政府支持情況:無(wú)

氮、磷過(guò)度排放導(dǎo)致的水體富營(yíng)養(yǎng)化成為全球水環(huán)境面臨的挑戰(zhàn)之一，特別是由此引發(fā)的藍(lán)藻爆發(fā)、水體生態(tài)功能喪失及飲用水資源危機(jī)成為各國(guó)政府亟待解決的關(guān)鍵問(wèn)題。如何實(shí)現(xiàn)氮磷營(yíng)養(yǎng)鹽的合理分配和調(diào)控，成為防止水體富營(yíng)養(yǎng)化和構(gòu)建完善的水體生態(tài)系統(tǒng)的核心和關(guān)鍵。微生物活化設(shè)備照片 同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院柴曉利教授團(tuán)隊(duì)研發(fā)的水體微生物活化技術(shù)，突破了傳統(tǒng)旁通水處理工藝、水生動(dòng)植物修復(fù)技術(shù)的不足，通過(guò)激活土著優(yōu)勢(shì)菌種，使之快速增殖，打破原有水體微生態(tài)平衡，用水體本身容積代替?zhèn)鹘y(tǒng)的有限生物反應(yīng)器，大大增加微生物的增殖空間，充分發(fā)揮微生物對(duì)污染物的削減能力，改善生態(tài)系統(tǒng)賴(lài)以生存的透明度、營(yíng)養(yǎng)鹽等不利條件，重組、完善水體微生態(tài)系統(tǒng)，恢復(fù)水體自?xún)裟芰?，最終脫離人工干預(yù)回歸自然，具有重要的實(shí)際應(yīng)用意義。 基于微生物調(diào)控的水體原位修復(fù)技術(shù)解決了地表水環(huán)境輕度污染水體（富營(yíng)養(yǎng)化）治理的技術(shù)瓶頸，引領(lǐng)了低污染負(fù)荷飲用水水源地氮素污染控制技術(shù)的發(fā)展方向，具有重要的社會(huì)環(huán)境效益。目前該技術(shù)已經(jīng)獲得相關(guān)授權(quán)專(zhuān)利11項(xiàng)，在全國(guó)十幾個(gè)省市30多個(gè)水生態(tài)修復(fù)工程項(xiàng)目中得到了推廣應(yīng)用，累積項(xiàng)目合同額超過(guò)3億元。

抗菌肽( Antibacterial peptides) 是由動(dòng)植物細(xì)胞內(nèi)特定基因編碼，經(jīng)外界條件誘導(dǎo)產(chǎn)生的一類(lèi)對(duì)細(xì)菌、真菌及病毒等微生物具有殺傷作用的多肽?？咕牟煌诳股氐淖饔脵C(jī)制?？咕膶?duì)細(xì)菌、真菌、病毒和腫瘤等均有作用，尤其對(duì)耐藥性細(xì)菌有殺滅作用，具有廣譜性。 本項(xiàng)目主要涉及4種不同來(lái)源抗菌肽工程菌株以及生產(chǎn)工藝。具體為：美洲擬鰈抗菌肽Pleurocidin、果蠅抗菌肽Metchnikowin、假黑盤(pán)菌抗菌肽-菌絲霉素Plectasin以及梭魚(yú)娃2-RPLX等4種抗菌肽發(fā)酵生產(chǎn)工程菌株及菌株高效發(fā)酵生產(chǎn)工藝。 技術(shù)指標(biāo)（創(chuàng)新要點(diǎn)等）： 1. 抗菌肽工程菌株的構(gòu)建 2. 抗菌肽的分離純化以及活性鑒定； 3. 抗菌肽發(fā)酵生產(chǎn)工藝參數(shù)及流程。 抗菌肽的生物活性主要有抑制或殺滅細(xì)菌作用、抗真菌作用、抗病毒活性、抗寄生蟲(chóng)作用、免疫調(diào)節(jié)作用以及抑制或殺傷腫瘤細(xì)胞作用。目前主要應(yīng)用領(lǐng)域包括但不限于作為抗生物替代品用于醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)、飼料工業(yè)、食品工業(yè)。

手性氨基酸作為最重要的原料和中間體，市場(chǎng)規(guī)模也越來(lái)越大。本項(xiàng)目研發(fā)的手性氨基酸包含 L-2-氨基丁酸、D-蘇氨酸、L-天冬酰胺、L-叔亮氨酸、L-色氨酸等。2-氨基丁酸是一種非天然的氨基酸，是一種重要的化工原料，被用作為多種手性藥物合成中的重要中間體，包括抗結(jié)核藥物乙胺丁醇、布瓦西坦和抗癲癇 藥物左乙拉西坦。D-蘇氨酸是天然氨基酸 L-蘇氨酸的光學(xué)異構(gòu)體，是一種非天然氨基酸。主要應(yīng)用于手性藥物、手性添加劑和手性助劑等領(lǐng)域，在制藥行業(yè)作為手性合成的手性源，主要用于生產(chǎn)新型光譜抗生素、D-蘇氨醇和多肽合成過(guò)程的蘇氨酸保護(hù)劑。L-天冬酰胺是常見(jiàn)的 20 種氨基酸之一，在食品、醫(yī)藥、化工合成、微生物培養(yǎng)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。L-天冬酰胺可以作為添加劑用于清涼飲料,同時(shí)在腫瘤治療及蛋白質(zhì)糖基化中扮演重要角色。L-天冬酰胺常用于氨基酸輸液，以及具有降壓、平喘、抗消化性潰瘍、胃功能障礙等功能，并可用于治療心肌梗死、心肌代謝障礙、心力衰竭、心臟傳導(dǎo)阻滯、疲勞癥等。此外，L-天冬酰胺也是微生物培養(yǎng)和動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)重要的添加劑。L-叔亮氨酸是一種非蛋白原的手性氨基酸, 由于叔丁基的空間位阻大, 叔亮氨酸的衍生物可在不對(duì)稱(chēng)合成中作為誘導(dǎo)不對(duì)稱(chēng)的模板。隨著不對(duì)稱(chēng)合成的發(fā)展, 叔亮氨酸的應(yīng)用也非常廣泛。又由于占空間大的叔丁基鏈及其疏水性, 它在多肽的合成中能夠很好地控制分子構(gòu)象, 增加多肽的疏水性和受酶降解的穩(wěn)定性, 因此在藥物和生物應(yīng)用中正迅速地發(fā)展, 用于抗癌、抗艾滋病等藥物和生物抑制劑及肽等。

L-甲硫氨酸廣泛應(yīng)用于飼料業(yè)，是家禽飼料中首選的限制性氨基酸。L-甲硫氨酸是強(qiáng)肝解毒劑、促進(jìn)發(fā)育劑，當(dāng)缺乏時(shí)會(huì)引起食欲減退。甲硫氨酸廣泛應(yīng)用于營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充與畜產(chǎn)飼料，由于甲硫氨酸容易被雞吸收而轉(zhuǎn)變?yōu)殡u肉蛋白，在雞飼料中添加甲硫氨酸，可少耗飼料，并使雞肉生長(zhǎng)健全。L-甲硫氨酸合成方法主要為化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法兩種。因化學(xué)合成法會(huì)產(chǎn)生大量有害物質(zhì)，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)甲硫氨酸越來(lái)越受到關(guān)注。本實(shí)驗(yàn)室以谷氨酸棒狀桿菌為出發(fā)菌株，通過(guò)代謝工程技術(shù)手段進(jìn)行基因敲除和敲入，以達(dá) 到“開(kāi)源節(jié)流”，即增強(qiáng) L-甲硫氨酸合成路徑代謝流，抑制或阻斷旁路途徑代謝流，最終提高 L-甲硫氨酸產(chǎn)率，目前中間菌株產(chǎn)率已達(dá) 21 mmol/L，具有重要的應(yīng)用前景。 

L-蘇氨酸在食品、飼料、醫(yī)藥和化妝品等領(lǐng)域的用量呈長(zhǎng)期穩(wěn)定增長(zhǎng)趨勢(shì)，尤其在飼料添加劑中增長(zhǎng)最為迅速。以添加了 L-蘇氨酸的低蛋白配方飼料作為家禽日糧，不但可以緩解天然蛋白的匱乏，減少動(dòng)物氨的排放，還能提高家禽的生產(chǎn)性能。而在醫(yī)藥領(lǐng)域，L-蘇氨酸除了用于氨基酸輸液之外，隨著人類(lèi)保健意 識(shí)的提高，各類(lèi)氨基酸保健飲品涌現(xiàn)市場(chǎng)，L-蘇氨酸是必不可少的配方成分。L-蘇氨酸有望取代色氨酸，成為繼賴(lài)氨酸和甲硫氨酸之后第三大發(fā)展最迅速的氨基酸。因此 L-蘇氨酸產(chǎn)業(yè)迫切需要提高產(chǎn)量，降低成本，以滿(mǎn)足市場(chǎng)需求。本實(shí)驗(yàn)室以谷氨酸棒狀桿菌為出發(fā)菌株，通過(guò)代謝工程技術(shù)手段進(jìn)行基因敲除和敲入，對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行了測(cè)序、蛋白結(jié)構(gòu)解析及定向改造，以達(dá)到“開(kāi)源節(jié)流”，即增強(qiáng) L-蘇氨酸合成路徑代謝流，抑制或阻斷旁路途徑代謝流，最終提高L-蘇氨酸產(chǎn)率近 20 倍，具有較好的應(yīng)用前景。

傳統(tǒng)發(fā)酵食品加工過(guò)程中生成的胺(氨)類(lèi)物質(zhì)，如氨基甲酸乙酯（EC）、生物胺類(lèi)等是影響發(fā)酵食品安全的重要因素。本成果在國(guó)內(nèi)外率先進(jìn)行了微生物干預(yù)減少發(fā)酵食品中 EC 及其前體的系統(tǒng)研發(fā)。主要技術(shù)內(nèi)容包括： (1) 揭示了醬油發(fā)酵過(guò)程 EC 前體形成的微生物物質(zhì)代謝機(jī)制； (2) 采用高通量篩選方法獲得可在醬油發(fā)酵過(guò)程中顯著減少 EC 前體積累的菌株； (3) 采用非基因工程手段在工業(yè)規(guī)模將醬油中 EC 含量降至低于 20 ppb，且對(duì)醬油主要理化指標(biāo)和風(fēng)味物質(zhì)未產(chǎn)生影響。本成果已獲授權(quán)核心發(fā)明專(zhuān)利 11 項(xiàng)，形成了包括利用 EC 或其前體菌株的篩 選與選育、微生物干預(yù)控制醬油中氨(胺)類(lèi)有害物的專(zhuān)利群，發(fā)表論文 29 篇。 本技術(shù)對(duì)于解決基于混菌發(fā)酵過(guò)程的傳統(tǒng)發(fā)酵食品安全性的提升，具有普適性意 義和推廣前景；對(duì)于引領(lǐng)生物技術(shù)在傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的應(yīng)用、提升傳統(tǒng)發(fā)酵食品生產(chǎn)企業(yè)的技術(shù)水平、實(shí)現(xiàn)傳統(tǒng)發(fā)酵食品工業(yè)產(chǎn)業(yè)升級(jí)和可持續(xù)發(fā)展，具有重大 的科學(xué)意義和工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。 

本發(fā)明公開(kāi)了一種海洋微生物原位富集裝置，包括：開(kāi)式培養(yǎng)艙、閉式培養(yǎng)艙、環(huán)境監(jiān)測(cè)傳感器。開(kāi)式培養(yǎng)艙包括開(kāi)式艙體和上蓋，上蓋能夠在驅(qū)動(dòng)裝置帶動(dòng)下垂直向上開(kāi)啟，以打開(kāi)開(kāi)式艙體；閉式培養(yǎng)艙包括閉式艙體，所述閉式艙體上設(shè)置有進(jìn)水口和出水口，閉式艙體內(nèi)設(shè)置有蠕動(dòng)泵，實(shí)現(xiàn)閉式艙體內(nèi)與外部海水交換；環(huán)境監(jiān)測(cè)傳感器設(shè)置有三組，分別位于所述開(kāi)式培養(yǎng)艙內(nèi)、閉式培養(yǎng)艙內(nèi)以及外部環(huán)境中，用于檢測(cè)環(huán)境的PH值、溶解氧、濁度、甲烷等環(huán)境參數(shù)。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了在海洋原位對(duì)微生物進(jìn)行富集，使微生物富集過(guò)程中的環(huán)境與微生物生長(zhǎng)的環(huán)境相同，提高了微生物的生存適應(yīng)性，避免因環(huán)境的改變?cè)斐晌⑸锏乃劳龌蚧钚越档汀?

已有樣品/n首次實(shí)現(xiàn)利用葡萄糖為原料微生物高效合成紅景天苷，在30升發(fā)酵罐，發(fā)酵60h，紅景天苷產(chǎn)量可達(dá)10克/升，已初步建立了提取工藝。與化學(xué)合成法相比，微生物合成紅景天苷具有反應(yīng)條件溫和、目標(biāo)產(chǎn)物可以發(fā)酵大量生產(chǎn)的特點(diǎn)，紅景天苷主要存在于發(fā)酵液中，提取工藝簡(jiǎn)單。紅景天苷微生物合成技術(shù)，與傳統(tǒng)生產(chǎn)方法相比，降低了生產(chǎn)成本和環(huán)境污染，實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展，具有很好的應(yīng)用前景。從植物中提取的紅景天苷成本3萬(wàn)元/公斤，化學(xué)合成紅景天苷成本1萬(wàn)元/公斤。以目前的發(fā)酵水平10克/升計(jì)算，研究所技術(shù)生產(chǎn)的紅景天苷預(yù)

全球氨基酸市場(chǎng)需求增長(zhǎng)勢(shì)頭強(qiáng)勁，年均增長(zhǎng)5.6%以上。2017年，全球年產(chǎn)量已達(dá)850萬(wàn)噸，總銷(xiāo)售額超百億美元。目前，氨基酸的生產(chǎn)主要有三種方法，包括微生物發(fā)酵法、化學(xué)合成法和酶法水解法等。其中，微生物發(fā)酵法因其產(chǎn)能高、成本低等優(yōu)勢(shì)，作為最主要的方法，生產(chǎn)了全球總產(chǎn)量85%以上的氨基酸。為應(yīng)對(duì)不斷升級(jí)的市場(chǎng)需求，氨基酸發(fā)酵企業(yè)亟需提高發(fā)酵產(chǎn)量和拓展氨基酸品種，而關(guān)鍵在于獲得氨基酸高產(chǎn)菌株。現(xiàn)有的氨基酸高產(chǎn)菌株篩選方法如氨基酸類(lèi)似物篩選法，存在毒性高、陽(yáng)性率低及種類(lèi)受限等問(wèn)題，無(wú)法滿(mǎn)足篩選需求。因此，開(kāi)發(fā)全新的氨基酸高產(chǎn)菌株篩選方法具有十分重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值。 項(xiàng)目組通過(guò)增加序列中稀有密碼子的數(shù)量來(lái)提高蛋白翻譯所需氨基酸濃度的“門(mén)檻值”，利用必需基因和顏色蛋白編碼基因，建立了氨基酸高產(chǎn)菌株的選擇和篩選體系，并證明了該方法在大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌中的可行性。本研究為氨基酸高產(chǎn)菌株的篩選提供了新系統(tǒng)，理論上可用于任何一種天然氨基酸高產(chǎn)菌株的篩選，同時(shí)也為氨基酸高產(chǎn)機(jī)制的發(fā)現(xiàn)提供了新思路，可用于氨基酸發(fā)酵生產(chǎn)中優(yōu)良菌株的構(gòu)建，進(jìn)而推動(dòng)氨基酸市場(chǎng)的增長(zhǎng)，促進(jìn)氨基酸在飼料、食品、醫(yī)藥等民生領(lǐng)域的應(yīng)用。 目前，微生物細(xì)胞工廠的遺傳改造已經(jīng)基本完成，正在進(jìn)一步的改造。發(fā)酵生產(chǎn)的濃度、產(chǎn)率和速率都達(dá)到國(guó)際先進(jìn)水平。進(jìn)一步的提高正在研究進(jìn)行中。